Razumijevanje konfokalne fluorescentne mikroskopije
Osnovno načelo konfokalne fluorescentne mikroskopije: Koristite točkasti izvor svjetlosti za osvjetljavanje uzorka kako biste formirali malu, dobro definiranu svjetlosnu točku na žarišnoj ravnini. Fluorescenciju koju emitira točka nakon što je osvijetljena skuplja leća objektiva i vraća u dikroično zrcalo duž izvorne putanje svjetlosti osvjetljenja. čine razdjelnik snopa. Spektrometar šalje fluorescenciju izravno na detektor. Ispred izvora svjetlosti i detektora nalazi se rupica, koja se naziva rupica za osvjetljavanje i rupica za otkrivanje. Geometrijske dimenzije ove dvije su dosljedne, oko 100-200nm; relativno u odnosu na svjetlosnu točku na žarišnoj ravnini, dvije su konjugirane, to jest, svjetlosna točka prolazi kroz niz leća i na kraju se može fokusirati na rupicu za osvjetljavanje i rupicu za detekciju u isto vrijeme. Na ovaj način, svjetlost iz žarišne ravnine može se koncentrirati unutar raspona detekcijske rupe, dok se raspršena svjetlost iznad ili ispod žarišne ravnine blokira izvan detekcijske rupe i ne može se prikazati. Uzorak se laserom skenira točku po točku, a fotomultiplikatorska cijev iza detekcijske rupice također dobiva konfokalnu sliku odgovarajuće svjetlosne točke točku po točku, koja se pretvara u digitalni signal i prenosi u računalo, te na kraju agregira na zaslon u jasnu konfokalnu sliku cijele žarišne ravnine. .
Svaka slika žarišne ravnine zapravo je optički presjek uzorka. Ovaj optički presjek uvijek ima određenu debljinu i naziva se i optički tanki presjek. Budući da je intenzitet svjetla u fokusu puno veći od intenziteta svjetla u nefokusu, a svjetlost nefokalne ravnine filtrira se rupom, dubina polja konfokalnog sustava je približno nula. Skeniranje duž smjera Z-osi može realizirati optičku tomografiju, formirajući željeni dvodimenzionalni optički presjek na fokusiranoj točki uzorka. Kombinacijom skeniranja XY ravnine (žarišne ravnine) sa skeniranjem Z-osi (optičke osi), prikupljanjem kontinuiranih razina dvodimenzionalnih slika i njihovom obradom specijaliziranim računalnim softverom, može se dobiti trodimenzionalna slika uzorka.
To jest, rupica za otkrivanje i rupica za izvor svjetlosti uvijek su fokusirane na istu točku, tako da fluorescencija pobuđena izvan fokusne ravnine ne može ući u rupicu za detekciju.
Jednostavan izraz principa rada laserskog konfokalnog lasera je da koristi laser kao izvor svjetlosti. Na temelju tradicionalnog snimanja fluorescentnim mikroskopom dodaju se uređaj za lasersko skeniranje i uređaj za konjugirano fokusiranje, a sustavom upravlja računalo za prikupljanje i obradu digitalnih slika.
