Zašto je povećanje uljne leće veće od običnog objektiva?
Razlozi zašto se bakterije moraju fiksirati prije bojanja u mikrobiološkim pokusima:
1: Ubija stanice, lako se boji bojom.
2: Neka bakterije prianjaju na predmetno staklo i nije ih lako isprati vodom.
Prilikom fiksiranja treba se polako sušiti. Ako baš želite ubrzati, možete ga nekoliko puta osušiti u daljini iznad plamena alkoholne lampe. Ne dopustite da se staklo zagrije, inače može uništiti životni oblik bakterija.
Bojanje po Gramu i mikroskopsko promatranje bakterija
1. Eksperimentalni princip
Princip bojenja po Gramu: Bakterije različito reagiraju na bojenje po Gramu zbog sastava i strukture njihovih staničnih stijenki. Stanična stijenka Gram-pozitivnih bakterija uglavnom je mrežasti čvor kojeg tvori peptidoglikan. Kada se tretira etanolom, veličina pora mrežne strukture postaje manja zbog dehidracije, a propusnost se smanjuje, tako da se kompleks kristalno ljubičasto-jod tvar ne može lako eluirati i zadržati u stanici, a plavo- ljubičasta boja primarnog agensa za bojenje još uvijek je zadržana nakon dekolorizacije i kontrastnog bojanja. Sloj peptidoglikana stanične stijenke Gram-negativnih bakterija je tanak, a sadržaj lipida visok, pa kada se provodi tretman dekolorizacije, lipid se otapa etanolom (ili acetonom), a propusnost stanične stijenke se povećava, pa da se kompleks kristal violet-jod Lakše eluira, a nakon kontrabojanja kontrabojom stanice se boje crvenom bojom kontraboja. Princip mikroskopske slike: Moderni obični optički mikroskopi koriste dva sustava leća okulara i leće objektiva za povećanje slike, pa se često nazivaju složeni mikroskopi. U optičkom sustavu mikroskopa najkritičnija je izvedba leće objektiva, a najveće je povećanje uljne leće, što je najvažnije za mikrobiološka istraživanja. Glavna svrha dodavanja imerzijskog ulja između predmetnog stakla i leće je povećati svjetlinu osvjetljenja i povećati rezoluciju mikroskopa. Ulje se koristi umjesto zraka kao medij za prijenos svjetlosti kako bi se smanjio lom ili totalna refleksija svjetlosti i promatrana slika učinila jasnijom.
2. Eksperimentalna oprema
1. Kolonije:
Escherichia coli 24-satna kosa kultura na hranjivom agaru,
Staphylococcus aureus oko 24h hranjiva kosa agar kultura, Bacillus subtilis 12-18h hranjiva kosa agar kultura.
2. Otopine ili reagensi:
Destilirana voda, otopina joda, otopina za bojenje kristalno ljubičastom, 95 postotni alkohol, otopina za bojenje safranina, cedrovo ulje. 3. Instrument:
Mikroskop, predmetno staklo, petlja za inokulaciju, alkoholna lampa, pinceta, maramica za leće.
3. Eksperimentalni koraci
a:
1. Razmazati
Izvadite predmetno stakalce, zapalite stakalce, spalite alkohol na stakalcu i sterilizirajte ga, stavite malu kap destilirane vode u sredinu, upotrijebite omču za inokulaciju da nježno pokupite malu količinu bakterija na kosoj podlozi testa epruveta, Tijekom cijelog procesa, otvor epruvete trebao bi biti iznad alkoholne lampe, a brzina bi trebala biti velika kako bi se spriječila kontaminacija medija kulture. Zatim kružnim pokretima razmažite male kapljice vode po predmetnom staklu, prestanite kada se kapljice vode zamute i pričekajte da se osuše i fiksiraju.
2. Primarno bojenje
Kapnite kristalno ljubičasto (prikladno je samo pokriti bakterijski film) na koloniju, bojite 1-2 minuta, izlijte otopinu za bojenje i isperite finom vodom s vrha stakalca dok eluat ne postane bezbojan, i stavite mrlju na stakalce. Otresite vodu na kriške.
3. Mordant
Dodati otopinu joda kap po kap da ispere zaostalu vodu, poklopiti oko 1 minutu i isprati vodom.
4. Dekolorizacija
Otresite vodu na predmetnom stakalcu, nagnite predmetno staklo i dodajte 95 posto alkohola da biste ga obezbojili ispod bijele pozadine, sve dok alkohol koji istječe ne postane plav, odmah isperite alkohol vodom i stavite stakleni predmet Protresite od vode na kriške.
5. Kontrabojenje
Obojite otopinom safranina oko 1-2 minuta, operite vodom, a zatim osušite upijajućim papirom
6. Mikroskopski pregled:
Potražite bakterijsku koloniju koju treba promatrati pod lećom malog povećanja (nastavite pomicati stakalce, ako osjetite crvenu sjenu, odmah prestanite, prilagodite povećanje, ako nije kolonija, nastavite s pronalaženjem), podignite cijev leće, a zatim se prebacite na uljno ogledalo. Dodajte kap cedrovog ulja na područje uzorka i pažljivo spustite cijev leće s grubim regulatorom tako da uljna leća bude uronjena u ulje i gotovo dodiruje uzorak. Podignite kondenzor u najviši položaj i potpuno otvorite otvor blende, koristite grubo podešavanje da polako podignete cijev leće dok se slika objekta ne pojavi u vidnom polju i koristite fino podešavanje da bude jasna i u fokusu.
